在化學(xué)分析與生物檢測領(lǐng)域，顯色試劑DA64 - DA67的使用涵蓋了從顯色溶液的精確配制、樣本與顯色溶液的反應(yīng)孵育，到吸光度檢測與結(jié)果確定等一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)牟僮鞑襟E。只有嚴(yán)格按照這些步驟進(jìn)行操作，才能充分發(fā)揮DA64 - DA67的顯色性能，為化學(xué)分析與生物檢測提供準(zhǔn)確、可靠的數(shù)據(jù)。

一、用于常規(guī)樣本檢測的顯色溶液制備與操作 
1、顯色溶液的精確配制：在準(zhǔn)備配制顯色溶液前，需確保實驗環(huán)境清潔，所用儀器如容量瓶、移液器等均經(jīng)過校準(zhǔn)且潔凈干燥。取4.08 mg DA67，這一質(zhì)量的準(zhǔn)確稱取是關(guān)鍵，其直接關(guān)系到最終顯色溶液的濃度準(zhǔn)確性。將稱取好的DA67放入預(yù)先配置好的PIPES緩沖劑中，PIPES緩沖劑能為DA67提供穩(wěn)定的溶解環(huán)境，維持合適的酸堿度，保證DA67的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。接著，加入1 mL濃度為100 units/mL的過氧化物酶（POD）。過氧化物酶在后續(xù)的顯色反應(yīng)中扮演著關(guān)鍵的催化角色，其活性和加入量的準(zhǔn)確性對反應(yīng)進(jìn)程和結(jié)果影響顯著。將上述混合物在容量瓶中用PIPES緩沖劑定容至100 mL，通過精確的定容操作，得到濃度為100 μmol/L的DA67溶液。在定容過程中，需平視容量瓶刻度線，確保溶液體積準(zhǔn)確無誤，獲得濃度均一、穩(wěn)定的顯色溶液。
2、樣本與顯色溶液的混合反應(yīng)：取上述制備好的DA67溶液3 mL，轉(zhuǎn)移至潔凈的反應(yīng)容器中。同時，準(zhǔn)備10 μL樣本溶液，樣本溶液中含有不同濃度的H?O?，濃度范圍為0 - 5 mmol/L。將樣本溶液小心加入到DA67溶液中，確保兩者充分混合。此混合過程需輕柔操作，避免產(chǎn)生過多氣泡，影響后續(xù)反應(yīng)。 將混合后的溶液置于37°C的環(huán)境中培育5分鐘。37°C是模擬人體生理溫度的常用條件，在此溫度下，過氧化物酶能發(fā)揮最佳活性，催化DA67與H?O?之間的顯色反應(yīng)。培育時間的精準(zhǔn)控制也很重要，時間過短可能導(dǎo)致反應(yīng)不完全，無法產(chǎn)生足夠的顯色效果；時間過長則可能引發(fā)副反應(yīng)，干擾檢測結(jié)果。 

3、吸光度檢測與結(jié)果確定：培育完成后，使用分光光度計檢測溶液在666 nm處的吸光度。分光光度計需提前預(yù)熱并校準(zhǔn)，確保測量數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。在測量時，需以空白溶液作為對照，空白溶液是用蒸餾水替換樣本溶液后混合而成的溶液。通過測量空白溶液的吸光度，并將其從樣本溶液的吸光度中減去，得到的吸光度差作為最終檢測值。為了確定樣本中H?O?的含量，需要預(yù)先制作校準(zhǔn)曲線。校準(zhǔn)曲線是通過使用已知濃度的H?O?標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照與樣本溶液相同的操作步驟進(jìn)行反應(yīng)和測量吸光度，以H?O?濃度為橫坐標(biāo)，吸光度差為縱坐標(biāo)繪制而成。通過將樣本溶液的檢測值與校準(zhǔn)曲線進(jìn)行對比，即可準(zhǔn)確確定樣本中的H?O?含量。 

二、用于檢測POD活性的顯色溶液制備與操作 
1、準(zhǔn)備另一種顯色溶液用于檢測POD活性時，同樣先確保實驗儀器的準(zhǔn)確性和潔凈度。稱取4.08 mg DA67，加入到已配置好的Mcllvaine緩沖液中，該緩沖液的pH值為5.7，能為DA67和后續(xù)反應(yīng)提供特定的酸堿環(huán)境，利于反應(yīng)的進(jìn)行。向其中加入1 mL濃度為2%的H?O?。H?O?在此反應(yīng)體系中作為底物，與DA67在POD的催化下發(fā)生顯色反應(yīng)。將上述混合物在容量瓶中用Mcllvaine緩沖液定容至100 mL，通過精確的定容操作，得到用于檢測POD活性的顯色溶液。
2、樣本與顯色溶液的孵育反應(yīng)：取上述制備的顯色溶液2 mL，轉(zhuǎn)移至潔凈的反應(yīng)容器中。同時，準(zhǔn)備2 mL樣本溶液，樣本溶液中含有不同濃度的POD，濃度范圍為1 fmol - 1 pmol/tube POD。將樣本溶液與顯色溶液充分混合，輕柔攪拌，保證兩者均勻接觸。將混合后的溶液在37°C下孵育。在此溫度下，POD能夠催化DA67與H?O?之間的顯色反應(yīng)，使溶液顏色發(fā)生變化。孵育過程需保持環(huán)境溫度穩(wěn)定，避免溫度波動影響POD的活性和反應(yīng)進(jìn)程。 
3、吸光度檢測與POD活性確定：孵育結(jié)束后，使用分光光度計檢測溶液在666 nm處的吸光度。同樣，需以空白溶液作為對照，減去空白溶液的吸光度后，得到的吸光度差作為檢測值。預(yù)先制作用于檢測POD活性的校準(zhǔn)曲線，該曲線是通過使用已知濃度的POD標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照與樣本溶液相同的操作步驟進(jìn)行反應(yīng)和測量吸光度，以POD濃度為橫坐標(biāo)，吸光度差為縱坐標(biāo)繪制而成。通過將樣本溶液的檢測值與校準(zhǔn)曲線進(jìn)行對比，即可準(zhǔn)確確定樣本中的POD活性數(shù)值。

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